分子POCT,数来数去,也就这些设计

来源:呈晖医疗科技

作者：呈晖医疗

POCT，即时检验（point-of-caretesting），指在病人旁边进行的临床检测及床边检测（bedsidetesting），通常不一定是临床检验师来进行。其是在采样现场即刻进行分析，省去标本在实验室检验时的复杂处理程序，快速得到检验结果的一类新方法。POCT的主要标准是不需要固定的检测场所，试剂和仪器是便携式的，操作简便，并且可及时操作。最典型的POCT类产品就是胶体金试纸类的产品。

新冠疫情带动了核酸检测的大热。然而当前国内核酸检测的主流做法还是依托于标准的PCR实验室，由持有PCR上岗证的专业操作人员来进行检测。这里面最主要的逻辑还是借助于PCR分区实验室来有效的规避交叉污染。而分子POCT的显著特点是，仪器小（桌面式的居多）且核酸提取和扩增全自动、全密闭，因此理论上可以不依赖于PCR实验室。又因为简单操作就能给出检测结果（sampletoanswer-样本进结果出），理论上也不再需要专业的操作人员。更多相关内容可以阅读：微流控技术的产业化进展的第四部分。

当然，我们这里说的分子POCT，一定要全自动（带有核酸提取和核酸扩增的功能，能样本进结果出，全程不需要人工参与），全密闭。如果只是一个快速的QPCR仪，请千万不要用分子POCT的概念来误导大众。这种“概念膨胀”只会让人不知所云。QPCR仪必须放到标准的PCR实验室使用，怎么实现POCT呢？如果产品是典型开放式提取（上磁吸或者下磁吸），那产品的使用基本摆脱不了PCR实验室，那也不叫分子POCT。不信的话，再读读上面的POCT的定义。如果开放式提取和PCR扩增强行的集成在一个物理空间，那就更尴尬了——谁能告诉我这类产品放到PCR实验室里使用的话，该放在样本制备间还是扩增间呢？

今天我们就聊聊基于不同技术路线的分子POCT的优缺点。一家之言，仅供参考。如有争议，那你肯定是对的。

我们知道一个典型的核酸检测过程包括两大步骤：核酸提取和核酸扩增。而核酸提取又包括裂解和纯化。对于某些样本（比如宫颈拭子洗脱液，鼻咽拭子洗脱液等），其成分相对简单，因此在核酸提取中可以把核酸纯化步骤省略掉，因此叫免纯化提取，有的也叫一步法提取。为了确保对后续PCR反应没有明显的抑制，这种提取方法一般也会加一步高温让蛋白质失活。这种提取因为没有经过核酸纯化，提取后的核酸溶液里残留杂质较多，稍有不慎，还是会对后续的PCR反应产生抑制。但是因为相对于全提取（带有磁珠法或者过柱法纯化）而言，免纯化提取步骤简单很多，更容易实现提取的全自动，其在分子POCT领域也被经常采用。

根据笔者了解，免纯化核酸提取，相对于带纯化的核酸全提取，其检测灵敏度也普遍有至少一个数量级的差距。因此，可以大致这么理解免纯化提取：为了更简单地实现核酸检测全自动化，牺牲了检测灵敏度以简化核酸提取步骤。这里面最典型的产品是Mesa公司旗下的Accula和GenePOC旗下的revogene。Mesa已经于年被赛默飞4.5亿美元收购，而GenePOC也在年被Meridian1.2亿美元收购。对Mesa公司及其产品Accula感兴趣的，请阅读：Mesa微流控全自动核酸检测产品解析。

一步法提取除了检测灵敏度受限以外，这种方法也只适用于样本成分比较简单的情形。对于诸如血液样本、粪便样本等成分比较复杂的样本，一步法提取基本无能为力。

我们知道，对于核酸扩增而言最典型的扩增方式就是聚合酶链式反应（PCR）。PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制。

PCR基本反应步骤分为三步：

1、变性：反应温度在95℃维持15-30s左右，高温会使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。

2、退火（复性）：反应温度从95℃降温至60℃，在该温度下维持15-30s，引物与模板按照碱基互补配对原则进行结合。

3、延伸：将反应温度调节至酶的最适温度（72℃），在DNA聚合酶、4种dNTPs及镁离子等存在的条件下，形成与模板链互补的新的DNA链。

所以PCR是一个典型的变温过程，每经过一个完整的温度循环，靶基因片段的量理论上翻一番。正是因为PCR需要不断的温度循环，才导致PCR扩增需要的时间更久（更多内容可以阅读：核酸检测，如何更快？）。同时，PCR本身对于仪器的要求也更高（仪器需要不断地升降温，且需要较为精确的温度控制）。那么，核酸扩增能否摆脱对于温度循环的依赖，在一个恒定的温度下完成体外的核酸扩增呢？这就是恒温扩增（也叫等温扩增）技术。

恒温扩增技术，也是一种核酸体外扩增技术。与PCR相比，其反应过程始终维持在恒定的温度下。主流的恒温扩增技术包括LAMP、RPA、RAA、RCA、HDA、SAT、CPA以及NEAR等。

新冠疫情之下，国外风头正盛的家用核酸自检产品普遍采用的是一步法提取和恒温扩增。这里最主要考量的因素是仪器、耗材的成本以及检测时间。想仪器成本低，需要反复升降温并且要精确控温的PCR技术就不适合；想耗材成本低，就最好集成的步骤简单一些，那就一步法提取。同时，恒温扩增所需温度相对于PCR变性温度（95℃）而言要低得多，因此，恒温扩增技术对于检测耗材的封接要求也低得多。这也让基于恒温扩增技术的分子POCT产品的耗材更易实现量产。此外，由于恒温扩增技术不再像PCR反应那样需要不断地升降温，其扩增速度也更快。这样，基于恒温扩增技术的产品检测时间普遍更短。

当然，恒温扩增技术也有其显著的不足，否则当前核酸检测的主流技术也不会还是PCR了。首当其冲的是检测的准确性。通常情况下，恒温扩增技术的检测灵敏度会明显的低于PCR技术。说到这里，笔者不得不放一张私藏很久的PPT照片。

雅培的分子POCT产品IDNOW收购于Alere，其前身是Alerei。这是一款基于NEAR技术实现的分子POCT。而NEAR也是一种典型的恒温扩增技术。由于该产品十几分钟就能给出新冠核酸检测结果，又历经美国前总统特朗普带货的“政治秀”，在年新冠疫情早期也算是名噪一时。后来就不断有机构指出该款产品的检测准确性存疑。图中数据也显示，该款产品对于弱阳性样本有20%的假阴性。这是典型的检测灵敏度不足。

此外，由于PCR的广泛使用，上游原料供给更充分，产业链也更为成熟。因此，PCR反应试剂的原料成本也更低。对于恒温扩增技术，由于其当前并未被广泛使用，而且有些反应体系需要更多的酶，其试剂原料成本普遍高于PCR反应的试剂原料成本。

在分子POCT领域，我们知道最经典的产品就是来自赛沛的GeneXpert。该产品就是典型地采用了过柱法全提取技术和单扩增腔的QPCR技术。全提取和QPCR这对经典技术的组合使用有效地保证产品的灵敏度和特异性。对于GeneXpert而言，单个QPCR扩增腔配合六路荧光通道，使得单个GeneXpert的卡盒一次最多检测五个指标（内部质控占用了一个荧光通道）。所以，GeneXpert产品适合的是单样本少指标的检测场景，医院，门诊等等。当然，GeneXpert院内感染项目在住院部也有其使用场景，但是更适合的是病原体指征更为明显的情况。

CobasLiat也是典型的磁珠法全提取和单扩增腔QPCR的设计（两个腔是为了实现spacedomain的温度循环，实际就是一个QPCR扩增腔的效果），具体可以阅读：CobasLiat全自动核酸检测系统剖析。

在分子POCT领域，相较于GeneXpert，FilmArray则代表另一种检测逻辑。FilmArray通过一百零几个扩增腔来实现单样本多指标的检测。FilmArray的一个检测panel把引起某类疾病的常见病原体都筛查一遍，这样子就能帮医生精准定位出引来这类疾病的病原体是什么。比如，FilmArray上呼吸道感染检测panel囊括了22个检测指标，对于绝大多数具有上呼吸道感染症状的病人的样本而言，都可以在45分钟后给出准确的检测结果。想实现单样本多指标的检测，就要依赖于多个QPCR扩增腔的设计。类似的，STAT-Dx的DiagCORE也是通过8个QPCR扩增腔实现最多48个指标的检测，该公司于年被凯杰1.47亿美元收购。此类产品尤其适合危急重症感染的检测。

上述分类概述了分子POCT的产品形态及对应的优缺点。考虑到GeneXpert，FilmArray以及DiagCORE的销售额及装机量，我们基本上可以说全提取+QPCR技术路线当前还是分子POCT的主流担当。这里面最主要的考量还是检测的准确性。毕竟，无论是一步法提取（直扩法）还是恒温扩增，都削弱了核酸检测的准确性。除此以外，三个产品也一致的选择了微流控技术作为实现全自动和全密闭核酸检测的方式。

对于门诊、医院等单个样本指标需求少的场景，GeneXpert这种单PCR扩增腔少指标的产品已经足够使用，且更具性价比。对于住院部的危急重症感染，FilmArray这种多PCR扩增腔多指标筛查的产品的则更有效率。

对于产品开发而言，我们除了搞清楚产品的具体使用场景，也要考虑多指标筛查产品收费更贵（相应的病人的付费意愿及能力）。同时，多指标的分子POCT产品注册的费用和周期也是一大难题。FilmArray美国年获得第一个FDA证，而在刚刚（年）才获批第一个NMPA的证，这中间的曲折和坎坷，估计只有他们自己知道。

编者注：深圳市呈晖医疗科技有限公司是深圳市刚竹医疗科技有限公司全资子公司。呈晖医疗团队一直以来专注于研发基于微流控的全自动核酸检测系统，以解决当前核酸检测的痛点。

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